Генетическое направление

Быстро и достоверно определить наследственные свойства живых организмов можно с помощью анализа ДНК. Генетическое направление работ в ФБУ «Рослесозащита» является относительно новым, так как начало развиваться с 2008 года. Именно тогда в центральном аппарате учреждения в городе Пушкино Московской области была создана первая производственная лаборатория ДНК-анализа в системе Рослесхоза.

В совокупности успешное внедрение генетических технологий в практику лесного хозяйства позволяет повысить эффективность государственного лесного контроля, качество лесовосстановления и одновременно снизить потери лесных ресурсов от вредителей и болезней.

Добавление реактивов полуавтоматическим дозатором.                          Подготовка к выделению ДНК из образцов хвои проростков
Постановка ПЦР (полимеразной цепной реакции)
для расшифровки ДНК

ЭТО ВАЖНО

В роли ключевой и самой масштабной задачи выступает генетическая паспортизация основных лесообразующих пород из природных популяций. Реализация данного направления создает возможность установить границы ареала вида и внутривидовой дифференциации популяций лесообразующих пород, осуществлять контроль за соблюдением требований проведения лесосеменного районирования.

Для генетической паспортизации собирается биологический материал лесных растений в определенных точках. Для этого на всю территорию Российской Федерации условно наложена сеть квадратов 100x100 км. Образцы отбираются близко к точкам, находящимся в узлах этой «географической сетки». В перспективе предусмотрен другой тип деления – 50x50 км. В каждой точке собирают не менее 30 образцов, которые высушиваются и пересылаются в одну из лабораторий (все регионы поделены между семью лабораториями) для проведения генетических анализов, результаты которых заносятся в референсную базу данных.

---

Молекула ДНК является носителем генетической информации практически во всех живых организмах. Она состоит из двух комплементарных, то есть соответствующих друг другу, цепей нуклеотидов, формирующих уникальную последовательность. Расшифровка этой последовательности позволяет определить вид исследуемого материала.

---

Заготовка биологического материала для ДНК-анализа производится в насаждениях естественного происхождения. Растения, с которых берут образцы, отбираются случайным образом, при этом расстояние между ними должно быть не менее 15 м. В качестве объектов исследований могут выступать любые части растения (хвоя, листья, древесина, почки, семена, корни), но, как правило, собирается хвоя или листья, а если они недоступны, то образцы древесины. Таким образом в базе накапливаются сведения об индивидуальных особенностях лесообразующих пород каждого географического региона, они могут быть востребованы для решения задач мониторинга состояния лесных генетических ресурсов, оценки биологического разнообразия насаждений, осуществления контроля за оборотом репродуктивного материала при воспроизводстве лесов и соблюдения правил лесосеменного районирования, сертификации семян и посадочного материала лесных растений, а также оборота круглых лесоматериалов.

Проведение процесса выделения ДНК из образцов хвои                              Прибор (амплификатор) для проведения ПЦР 
в лабораторном боксе                                                                                       (полимеразной цепной реакции)

НАЙДЕТСЯ ВСЕ

Бывают случаи, когда болезнетворный организм трудно или невозможно определить традиционными методами. В подобных ситуациях, чтобы контролировать фитопатологическое состояние семян, сеянцев или взрослых деревьев, специалисты используют методы ДНК-диагностики.

С помощью анализа ДНК также можно идентифицировать видовую принадлежность фитопатогенов, когда визуально еще невозможно определить заболевание, и благодаря этому своевременно принять меры защиты. Наиболее современными и перспективными методами изучения фитопатогенов являются методы, позволяющие работать с видоспецифическими ДНК-маркерами (локусами). В фитопатологии ДНК-маркеры подбираются для каждого вида возбудителя болезни.

Оценка фитосанитарного состояния происходит следующим образом: при обследовании вначале внимательно осматривается вся необходимая площадь и оценивается состояние растений. Наличие пятен, некрозов, налетов, изменение окраски, необычное для здоровых растений, любые другие отклонения указывают на возможное присутствие заболеваний. Затем с разных участков берутся образцы для выяснения причины повреждения или гибели. Причем материалом для выделения ДНК могут быть не только части растения, но и вода или почва. Следует отметить, что многие методы ДНК-анализа способны обнаружить болезнетворный микроорганизм даже при условии, что в образце будет присутствовать только одна клетка патогена.

Второе направление в мониторинге состояния лесных генетических ресурсов – это контроль оборота репродуктивного материала лесных растений при воспроизводстве лесов. Работа в этом направлении позволяет предотвратить использование нерайонированных семян при воспроизводстве лесов, определить, с каких насаждений собраны семена (с лесосеменной плантации или из природной популяции), установить, соответствует ли заявленная видовая принадлежность семян фактической.

---

Преимуществами методов ДНК-анализа, в том числе с использованием видоспецифических маркеров, перед остальными группами методов являются высокая точность, чувствительность, быстрота выполнения анализов.

---

В отделе оценки качества лесных семян и федеральном фонде Рослесозащиты из проб семян, поступающих на проверку и определение класса качества, берутся семена для проведения генетических анализов. Таким образом постоянно пополняется база данных, которая содержит генетические характеристики контрольных образцов семян достоверно известного происхождения. Когда из этих семян в питомниках вырастают сеянцы, то для контроля оборота репродуктивного материала берутся образцы посадочного материала, из которых выделяется ДНК. Генетический анализ направлен на выявление индекса генетического сходства партии семян и выращенных из них сеянцев. Если полученный процент сходства имеет значение не ниже 95 %, то это указывает на отсутствие нарушений в обороте репродуктивного материала.

ПАСПОРТ ДЛЯ ДЕРЕВА

В лесном фонде России существуют лесосеменные плантации основных лесообразующих пород – лиственницы, сосны, в том числе кедровых сосен, ели, дуба и других. На этих плантациях высажены растения, привитые черенками плюсовых деревьев (лучших экземпляров деревьев, отобранных в свое время по комплексу морфологических признаков). Семена, собранные с этих плантаций, относятся к категории «улучшенные» и отличаются от семян, собранных в обычных насаждениях, лучшими наследственными свойствами. Предполагается, что леса, выращенные из таких семян, будут расти быстрее и плодоносить обильнее.

В задачи генетической паспортизации объектов лесного семеноводства входит: формирование «генетических паспортов» обследуемых деревьев, проверка схем смешения клонов на лесосеменных плантациях, результаты которых будут учтены при разработке рекомендаций по устранению нарушений при их выявлении. «Генетический паспорт» представляет собой всю информацию, полученную в ходе изучения определенных участков ДНК материнского или плюсового дерева и вегетативного потомства.

Определить на плантации по внешним признакам, к какому именно плюсовому дереву относится то или иное растение, невозможно. Здесь поможет только анализ ДНК. ДНК не изменяется в течение всей жизни любого организма, она одинакова в любой его части и характерна только для него. Так что ДНК плюсового дерева и его привитого вегетативного потомка (который еще называют клоном) одна и та же. Клоны на плантации изначально высаживают по специально разработанной схеме смешения, чтобы создать условия для перекрестного опыления. Лес растет долго, и клоны иногда погибают, тогда на их месте высаживают другие клоны. Иногда погибает прививка, и начинает развиваться подвой. Негативное влияние на развитие и рост клонов оказывают стихийные бедствия, человеческий фактор. Все это приводит к тому, что к моменту плодоношения привитых деревьев первоначальная схема размещения клонов часто оказывается в той или иной степени нарушенной.

  Определить на плантации по внешним признакам, к какому именно плюсовому дереву относится то или иное растение, невозможно. Здесь поможет только анализ ДНК. ДНК не изменяется в течение всей жизни любого организма, она одинакова в любой его части и характерна только для него. Так что ДНК плюсового дерева и его привитого вегетативного потомка (который еще называют клоном) одна и та же. Клоны на плантации изначально высаживают по специально разработанной схеме смешения, чтобы создать условия для перекрестного опыления. Лес растет долго, и клоны иногда погибают, тогда на их месте высаживают другие клоны. Иногда погибает прививка, и начинает развиваться подвой. Негативное влияние на развитие и рост клонов оказывают стихийные бедствия, человеческий фактор. Все это приводит к тому, что к моменту плодоношения привитых деревьев первоначальная схема размещения клонов часто оказывается в той или иной степени нарушенной.

---

КАКИМИ МЕТОДАМИ?

Изучение ДНК проводится с применением следующих методов (в зависимости от поставленных задач): ПЦР, электрофорез, капиллярное секвенирование, фрагментный анализ.

---

Сравнивая ДНК клонов на плантациях и плюсовых деревьев, как раз и уточняют схему размещения клонов с целью определения судьбы изучаемой плантации. Ведь от степени нарушения первоначальной схемы зависит, какие именно шаги будут предприняты: полная или частичная реконструкция или другие мероприятия.

Важно выявить возможные несоответствия клонов предполагаемым плюсовым деревьям, так как указанные объекты в дальнейшем планируются к использованию для заготовки семян улучшенного качества. Такая работа позволяет проводить идентификацию и сертификацию улучшенных семян, заготавливаемых на объектах лесного семеноводства и используемых для лесовосстановления. Совокупность ДНК клонов на плантации является ее «генетическим портретом», по которому можно определить генетическое происхождение семян.

Данный аспект имеет стратегическое значение, поскольку доля улучшенных и сортовых семян лесных растений, используемых при воспроизводстве лесов, определяет эффективность лесного семеноводства в будущем: с учетом продолжительности роста древесных растений, наследственные качества семян во многом определяют качество создаваемых насаждений через 50–100 лет.

 











Подготовка к проведению электрофореза


ИСТИНА В ДНК!

Недобросовестные производители зачастую пытаются выдать за улучшенные обычные семена. Вести эффективный контроль за действиями таких злоумышленников теперь можно благодаря разработке ФБУ «Рослесозащита». Специалистами государственной организации был разработан способ установления принадлежности партии семян к определенной селекционной категории (нормальные или улучшенные) с использованием методов ДНК-диагностики. Подобная разработка также позволяет достоверно устанавливать, в каком насаждении заготовлена партия семян сосны или ели – в естественном насаждении или на лесосеменной плантации.

Из высушенного образца, масса которого около 40 мг, выделяется ДНК, ее анализ осуществляется по целому ряду генетических параметров. Образцы ни в коем случае не должны подвергаться воздействию УФ-лучей, поскольку содержащаяся в них ДНК в этом случае будет разрушена.

Вначале образец растирают в ступке и добавляют буферный раствор – все это делает биологический материал однородным. Затем происходит этап очищения ДНК, осаждения и промывки в этиловом спирте. После этого для высушивания пробирку с раствором помещают в термостат при 60 °С. Образец ДНК на вид представляет собой каплю белого желеобразного осадка, напоминающего сгусток белка в яйце. Чтобы хранить ДНК и в дальнейшем проводить исследования, высушенный коагулят (осадок) растворяют в 50 мкл деионизированной воды при 40 °С. Растворенную ДНК хранят в морозильной камере при –20 °С для последующего анализа разных ее участков.

При сравнении ДНК образцов сравнивается основной показатель – молекулярная масса ДНК. Если фрагменты ДНК сравниваемых образцов будут одного молекулярного веса, то с высокой степенью вероятности можно делать вывод и об их идентичности.

Материалы предоставлены пресс-службой ФБУ «Рослесозащита»